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解決方案
抗體如何選擇
點(diǎn)擊次數(shù)：2304 日期：2014/3/12 13:28:46
檢測(cè)任何目的靶蛋白都有不止一種抗體可供選擇，為縮小抗體的選擇范圍選中合適的抗體，需要考慮如下幾種因素：
一、分析試驗(yàn)的應(yīng)用類型
一般抗體說明書都列出該抗體經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證過適用于何種分析類型，如：可以應(yīng)用于WB IHC ICC ELASA 分析等，如果抗體說明書沒有提及的應(yīng)用類型，并不意味著該抗體不適用于此種分析應(yīng)用類型，而僅是說明尚未經(jīng)過此種分析試驗(yàn)驗(yàn)證，如果抗體不適用 某些分析試驗(yàn)，則會(huì)在抗體說明書上標(biāo)注出來不適于某分析試驗(yàn)。
二、 樣本蛋白的結(jié)構(gòu)性質(zhì)
了解樣本蛋白的結(jié)構(gòu)性質(zhì)有助于選擇最合適的抗體，至少兩方面因素需要考慮：
1. 待測(cè)樣本蛋白的結(jié)構(gòu)域：抗體是由各種不同免疫原免疫宿主而制備得來，其中的免疫原包括：全長蛋白、蛋白片斷、多肽、全有機(jī)體（如：細(xì)菌）或細(xì)胞，抗體說明書一般都有免疫原的描述，如果打算檢測(cè)的是蛋白片斷或一種特殊的同型物或蛋白全長的某一區(qū)域，則必須選擇用含此片段域的免疫原制備出的抗體。如果打算用FACS 流式檢測(cè)活細(xì)胞的表面蛋白，則需要選擇含該表面蛋白的胞外域來免疫制備的抗體。
2. 樣本的提取或處理過程：某些抗體要求樣本經(jīng)過某些特殊處理，例如：許多抗體只識(shí)別還原和變性的、表位已暴露不受二級(jí)四級(jí)結(jié)構(gòu)阻礙的蛋白樣本，另一方面，某些抗體僅識(shí)別天然折疊狀態(tài)的蛋白。當(dāng)選擇免疫組化的抗體時(shí)，應(yīng)注意某些抗體只識(shí)別未固定的冷凍的組織，而另一些抗體則適用于無需抗原修復(fù)解交聯(lián)步聚的甲醛固定石蠟包埋的組織，這些都會(huì)在抗體說明書上應(yīng)用部分標(biāo)示出來。
三、樣本的物種
應(yīng)選擇物種相同或有交叉反應(yīng)的抗體，抗體可能與不同物種的同種靶蛋白有交叉反應(yīng)，因其氨基酸序列同源性較高，如果樣本的種類未列入抗體說明書上的交叉反應(yīng)種屬表中，并不意味著該抗體不適用于檢測(cè)該物種的蛋白，而只是表示該物種尚未用此抗體檢測(cè)驗(yàn)證過，應(yīng)通過序列比對(duì)的方法來預(yù)測(cè)交叉反應(yīng)，可應(yīng)用Expasy 和 NCBI BLAST 來進(jìn)行不同物種蛋白同源性比對(duì)。
四、一抗宿主物種的選擇
一般說來，在使用偶聯(lián)二抗結(jié)合無偶聯(lián)物的一抗時(shí)，一抗宿主動(dòng)物的物種選擇較為重要，對(duì)于免疫組化而言，盡可能選擇與樣本不同種系物種的一抗，從而避免二抗與樣本內(nèi)源性免疫球蛋白產(chǎn)生交叉反應(yīng)，例如：檢測(cè)小鼠樣本蛋白，則不應(yīng)選擇小鼠或大鼠源的 一抗，最好選兔源的一抗，則二抗則可選擇偶聯(lián)了檢測(cè)分子（酶、熒光素、生物素等）的抗兔IgG。
如果選擇有偶聯(lián)物的一抗則不適用上述情況，除免疫組化外的其它對(duì)不含內(nèi)源性免疫球蛋白樣本的檢測(cè)方法，則抗體宿主物種的影響不大，如對(duì)不含IgG 的細(xì)胞裂解物樣本的western blotting檢測(cè)，盡管如此，含有血清的組織裂解物和組織培養(yǎng)上清中含有免疫球蛋白，還原變性樣本中含IgG，在western blot 檢測(cè)中則結(jié)合出現(xiàn)IgG 分子50 and 25 kDa 的重鏈和輕鏈條帶。
抗體的品質(zhì)高低最終還是需要通過實(shí)驗(yàn)結(jié)果來呈現(xiàn)的，但是在選擇抗體之前我們并無法準(zhǔn)確判斷抗體的效果如何。無論什么品牌的，無論進(jìn)口還是國產(chǎn)的，都會(huì)有用得不錯(cuò)的產(chǎn)品，也都會(huì)有做不出來的產(chǎn)品�？贵w屬于異質(zhì)化產(chǎn)品，不同品牌之間，甚至同一品牌的不同產(chǎn)品之間，抗體品質(zhì)差異都較為明顯，而且沒有統(tǒng)一的衡量標(biāo)準(zhǔn)。這是抗體選擇中最難的一個(gè)問題。很多人習(xí)慣于根據(jù)實(shí)驗(yàn)室傳統(tǒng)意識(shí)或參考文獻(xiàn)上使用的產(chǎn)品進(jìn)行選擇，但是因?yàn)椴煌伍g的抗體效果也是有差異的，所以并不能完全確保正確選擇。在這種情況下，抗體的售后就尤為重要，遇到抗體品質(zhì)障礙時(shí)，能夠確保有效地解決問題，不至于影響實(shí)驗(yàn)的進(jìn)展�，F(xiàn)在有部分品牌可以提供免費(fèi)的抗體小樣的，無疑對(duì)這個(gè)問題是一個(gè)很好的解決方案。先確定抗體是否適合自己的實(shí)驗(yàn)，可以避免因?yàn)榭贵w質(zhì)量投訴耽誤實(shí)驗(yàn)安排。
在價(jià)格方面，需要謹(jǐn)記，最貴的不一定就是最好的，最適合你的實(shí)驗(yàn)的才是最好的。花很多錢買到很貴的抗體，再花上很長的時(shí)間去投訴的情況并不少見。只買對(duì)的，不買貴的。在選擇價(jià)格的時(shí)候還要注意規(guī)格大小、抗體濃度、效價(jià)范圍等，要綜合考慮。在規(guī)格方面，根據(jù)最終可以稀釋成的工作液的量的來衡量更為準(zhǔn)確。很多老品牌提供的抗體產(chǎn)品基本都是以大包裝為主，就單個(gè)課題的實(shí)驗(yàn)而言，過大的包裝有時(shí)會(huì)造成很大的浪費(fèi)。目前Proteintech、Bioworld、Cell Signal等品牌都相繼推出小包裝的抗體，這在一定程度上給選擇者更大的選擇自由度，可以根據(jù)使用產(chǎn)品的效價(jià)，計(jì)算出自己實(shí)際需要的抗體量，做到精確定量采購。
一、分析試驗(yàn)的應(yīng)用類型
一般抗體說明書都列出該抗體經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證過適用于何種分析類型，如：可以應(yīng)用于WB IHC ICC ELASA 分析等，如果抗體說明書沒有提及的應(yīng)用類型，并不意味著該抗體不適用于此種分析應(yīng)用類型，而僅是說明尚未經(jīng)過此種分析試驗(yàn)驗(yàn)證，如果抗體不適用 某些分析試驗(yàn)，則會(huì)在抗體說明書上標(biāo)注出來不適于某分析試驗(yàn)。
二、 樣本蛋白的結(jié)構(gòu)性質(zhì)
了解樣本蛋白的結(jié)構(gòu)性質(zhì)有助于選擇最合適的抗體，至少兩方面因素需要考慮：
1. 待測(cè)樣本蛋白的結(jié)構(gòu)域：抗體是由各種不同免疫原免疫宿主而制備得來，其中的免疫原包括：全長蛋白、蛋白片斷、多肽、全有機(jī)體（如：細(xì)菌）或細(xì)胞，抗體說明書一般都有免疫原的描述，如果打算檢測(cè)的是蛋白片斷或一種特殊的同型物或蛋白全長的某一區(qū)域，則必須選擇用含此片段域的免疫原制備出的抗體。如果打算用FACS 流式檢測(cè)活細(xì)胞的表面蛋白，則需要選擇含該表面蛋白的胞外域來免疫制備的抗體。
2. 樣本的提取或處理過程：某些抗體要求樣本經(jīng)過某些特殊處理，例如：許多抗體只識(shí)別還原和變性的、表位已暴露不受二級(jí)四級(jí)結(jié)構(gòu)阻礙的蛋白樣本，另一方面，某些抗體僅識(shí)別天然折疊狀態(tài)的蛋白。當(dāng)選擇免疫組化的抗體時(shí)，應(yīng)注意某些抗體只識(shí)別未固定的冷凍的組織，而另一些抗體則適用于無需抗原修復(fù)解交聯(lián)步聚的甲醛固定石蠟包埋的組織，這些都會(huì)在抗體說明書上應(yīng)用部分標(biāo)示出來。
三、樣本的物種
應(yīng)選擇物種相同或有交叉反應(yīng)的抗體，抗體可能與不同物種的同種靶蛋白有交叉反應(yīng)，因其氨基酸序列同源性較高，如果樣本的種類未列入抗體說明書上的交叉反應(yīng)種屬表中，并不意味著該抗體不適用于檢測(cè)該物種的蛋白，而只是表示該物種尚未用此抗體檢測(cè)驗(yàn)證過，應(yīng)通過序列比對(duì)的方法來預(yù)測(cè)交叉反應(yīng)，可應(yīng)用Expasy 和 NCBI BLAST 來進(jìn)行不同物種蛋白同源性比對(duì)。
四、一抗宿主物種的選擇
一般說來，在使用偶聯(lián)二抗結(jié)合無偶聯(lián)物的一抗時(shí)，一抗宿主動(dòng)物的物種選擇較為重要，對(duì)于免疫組化而言，盡可能選擇與樣本不同種系物種的一抗，從而避免二抗與樣本內(nèi)源性免疫球蛋白產(chǎn)生交叉反應(yīng)，例如：檢測(cè)小鼠樣本蛋白，則不應(yīng)選擇小鼠或大鼠源的 一抗，最好選兔源的一抗，則二抗則可選擇偶聯(lián)了檢測(cè)分子（酶、熒光素、生物素等）的抗兔IgG。
如果選擇有偶聯(lián)物的一抗則不適用上述情況，除免疫組化外的其它對(duì)不含內(nèi)源性免疫球蛋白樣本的檢測(cè)方法，則抗體宿主物種的影響不大，如對(duì)不含IgG 的細(xì)胞裂解物樣本的western blotting檢測(cè)，盡管如此，含有血清的組織裂解物和組織培養(yǎng)上清中含有免疫球蛋白，還原變性樣本中含IgG，在western blot 檢測(cè)中則結(jié)合出現(xiàn)IgG 分子50 and 25 kDa 的重鏈和輕鏈條帶。
抗體的品質(zhì)高低最終還是需要通過實(shí)驗(yàn)結(jié)果來呈現(xiàn)的，但是在選擇抗體之前我們并無法準(zhǔn)確判斷抗體的效果如何。無論什么品牌的，無論進(jìn)口還是國產(chǎn)的，都會(huì)有用得不錯(cuò)的產(chǎn)品，也都會(huì)有做不出來的產(chǎn)品�？贵w屬于異質(zhì)化產(chǎn)品，不同品牌之間，甚至同一品牌的不同產(chǎn)品之間，抗體品質(zhì)差異都較為明顯，而且沒有統(tǒng)一的衡量標(biāo)準(zhǔn)。這是抗體選擇中最難的一個(gè)問題。很多人習(xí)慣于根據(jù)實(shí)驗(yàn)室傳統(tǒng)意識(shí)或參考文獻(xiàn)上使用的產(chǎn)品進(jìn)行選擇，但是因?yàn)椴煌伍g的抗體效果也是有差異的，所以并不能完全確保正確選擇。在這種情況下，抗體的售后就尤為重要，遇到抗體品質(zhì)障礙時(shí)，能夠確保有效地解決問題，不至于影響實(shí)驗(yàn)的進(jìn)展�，F(xiàn)在有部分品牌可以提供免費(fèi)的抗體小樣的，無疑對(duì)這個(gè)問題是一個(gè)很好的解決方案。先確定抗體是否適合自己的實(shí)驗(yàn)，可以避免因?yàn)榭贵w質(zhì)量投訴耽誤實(shí)驗(yàn)安排。
在價(jià)格方面，需要謹(jǐn)記，最貴的不一定就是最好的，最適合你的實(shí)驗(yàn)的才是最好的。花很多錢買到很貴的抗體，再花上很長的時(shí)間去投訴的情況并不少見。只買對(duì)的，不買貴的。在選擇價(jià)格的時(shí)候還要注意規(guī)格大小、抗體濃度、效價(jià)范圍等，要綜合考慮。在規(guī)格方面，根據(jù)最終可以稀釋成的工作液的量的來衡量更為準(zhǔn)確。很多老品牌提供的抗體產(chǎn)品基本都是以大包裝為主，就單個(gè)課題的實(shí)驗(yàn)而言，過大的包裝有時(shí)會(huì)造成很大的浪費(fèi)。目前Proteintech、Bioworld、Cell Signal等品牌都相繼推出小包裝的抗體，這在一定程度上給選擇者更大的選擇自由度，可以根據(jù)使用產(chǎn)品的效價(jià)，計(jì)算出自己實(shí)際需要的抗體量，做到精確定量采購。
