活性氧檢測試劑盒使用說明書下載

點擊下載日期：2014/10/14 8:54:35

活性氧檢測試劑盒
產(chǎn)品簡介：
產(chǎn)品編號產(chǎn)品名稱產(chǎn)品包裝
SBJ0033 活性氧檢測試劑盒>100 次
活性氧檢測試劑盒(Reactive Oxygen Species Assay Kit)是一種利用熒光探針DCFH-DA
進(jìn)行活性氧檢測的試劑盒。DCFH-DA 本身沒有熒光，可以自由穿過細(xì)胞膜，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)后，
可以被細(xì)胞內(nèi)的酯酶水解生成DCFH。而DCFH 不能通透細(xì)胞膜，從而使探針很容易被裝載到
細(xì)胞內(nèi)。細(xì)胞內(nèi)的活性氧可以氧化無熒光的DCFH 生成有熒光的DCF。檢測DCF 的熒光就可
以知道細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平。
本試劑盒提供了活性氧陽性對照試劑Rosup，以便于活性氧的檢測。Rosup 是一種混合
物(compoundmixture),濃度為50mg/ml。
本試劑盒本底低，靈敏度高，線性范圍寬，使用方便。
本試劑盒可以測定100-500 個樣品。
包裝清單：
產(chǎn)品編號產(chǎn)品名稱包裝
SBJ0033-1 DCFH-DA(10mM) 0.1ml
SBJ0033-2 活性氧陽性對照(Rosup, 50mg/ml) 1ml
— 說明書1 份
使用說明：
1. 裝載探針
對于刺激時間較短(通常為2 小時以內(nèi))的細(xì)胞，先裝載探針，后用活性氧陽性對照或自
己感興趣的藥物刺激細(xì)胞。對于細(xì)胞刺激時間較長(通常為6 小時以上)的細(xì)胞，先用活性氧
陽性對照或自己感興趣的藥物刺激細(xì)胞，后裝載探針。
原位裝載探針：本方法僅適用于貼壁培養(yǎng)細(xì)胞。按照1:1000 用無血清培養(yǎng)液稀釋
DCFH-DA，使終濃度為10 微摩爾/升。去除細(xì)胞培養(yǎng)液，加入適當(dāng)體積稀釋好的DCFH-DA。
加入的體積以能充分蓋住細(xì)胞為宜，通常對于六孔板的一個孔加入稀釋好的DCFH-DA 不少于
1 毫升。37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 分鐘。用無血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞三次，以充分去除
未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。通�；钚匝蹶栃詫φ赵诖碳ぜ�(xì)胞20-30 分鐘后可以顯著提高活性
氧水平。
收集細(xì)胞后裝載探針：按照1:1000 用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA，使終濃度為10 微摩
爾/升。細(xì)胞收集后懸浮于稀釋好的DCFH-DA 中，細(xì)胞濃度為一百萬至二千萬/毫升，37℃細(xì)
胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 分鐘。每隔3-5 分鐘顛倒混勻一下，使探針和細(xì)胞充分接觸。用無血清
細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞三次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。直接用活性氧陽性對照或
自己感興趣的藥物刺激細(xì)胞，或把細(xì)胞等分成若干份后刺激細(xì)胞。通常活性氧陽性對照在刺
激細(xì)胞20-30 分鐘后可以顯著提高活性氧水平。
南京森貝伽生物科技有限公司
說明：僅在陽性對照孔中加入Rosup 作為陽性對照，其余孔不必加入Rosup。
2. 檢測
對于原位裝載探針的樣品可以用激光共聚焦顯微鏡直接觀察，或收集細(xì)胞后用熒光分光
光度計、熒光酶標(biāo)儀或流式細(xì)胞儀檢測。對于收集細(xì)胞后裝載探針的樣品可以用熒光分光光
度計、熒光酶標(biāo)儀或流式細(xì)胞儀檢測，用激光共聚焦顯微鏡直接觀察也可以。
3. 參數(shù)設(shè)置
使用488nm 激發(fā)波長，525nm 發(fā)射波長，實時或逐時間點檢測刺激前后熒光的強(qiáng)弱。DCF
的熒光光譜和
FITC 非常相似，可以用FITC 的參數(shù)設(shè)置檢測DCF。DCF 的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜參考下
圖。
4. 其它說明
陽性對照可以按照1:1000 的比例使用。例如裝載好探針的細(xì)胞共1 毫升，可以加入1
微升的陽性對照刺激。通常刺激后20-30 分鐘內(nèi)可以觀察到非常顯著的活性氧水平升高。對
于不同的細(xì)胞，活性氧陽性對照的效果可能有較大的差別。如果在刺激后30 分鐘內(nèi)觀察不
到活性氧的升高，可以適當(dāng)提高活性氧陽性對照的濃度。如果活性氧升高得過快，可以適當(dāng)
降低活性氧陽性對照的濃度。
另外，對于某些細(xì)胞，如果發(fā)現(xiàn)沒有刺激的陰性對照細(xì)胞熒光也比較強(qiáng)，可以按照
1:2000-1:5000 稀釋DCFH-DA，使裝載探針時DCFH-DA 的濃度為2-5 微摩爾/升。探針裝載的
時間也可以根據(jù)情況在15-60 分鐘內(nèi)適當(dāng)進(jìn)行調(diào)整。
活性氧陽性對照(Rosup)僅僅用于作為陽性對照的樣品，并不是在每個樣品中都需加入
活性氧陽性對照。
保存條件：
-20℃保存，一年有效。
注意事項：
探針裝載后，一定要洗凈殘余的未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的探針，否則會導(dǎo)致背景較高。
探針裝載完畢并洗凈殘余探針后，可以進(jìn)行激發(fā)波長的掃描和發(fā)射波長的掃描，以確認(rèn)
探針的裝載情況是否良好。DCF 的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜請參考下頁圖譜。
盡量縮短探針裝載后到測定所用的時間(刺激時間除外)，以減少各種可能的誤差。
為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。