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解決方案

BIOCHANNEL 培養(yǎng)建議 | AML12細胞

點擊次數(shù):1068  日期:2024/10/31 9:33:50

AML-12細胞是一種常用于研究肝臟疾病的細胞系。胚胎干細胞分泌因子能夠顯著增強AML-12細胞在惡劣培養(yǎng)條件下的抗凋亡能力,并且還能提高其糖酵解潛力、最大氧化呼吸能力以及氧化呼吸潛力。

 

AML12細胞胞體上有黑色顆粒及細胞胞體上有少量空泡是正,F(xiàn)象。該細胞培養(yǎng)體系較為特殊且對血清質(zhì)量較為敏感,并且需要添加ITS,地塞米松維持細胞狀態(tài),建議使用本庫配套培養(yǎng)體系(BC-C-MI-M-071)。

 

 

細胞培養(yǎng)步驟

【細胞復蘇】

1、取出1mL凍存管后,迅速放入37℃水浴鍋中不斷搖晃使其解凍,直至凍存管中無結(jié)晶(此過程盡量在2min內(nèi)完成);

2、準備15mL離心管,加入2-6mL完培,將凍存管中的細胞懸液移至離心管,1000 rpm離心3~5min;(比較難養(yǎng)的細胞可適量增加離心管中的完培)

3、吸棄上清,用新鮮培養(yǎng)基重懸細胞,接種至無菌的培養(yǎng)器皿中,輕晃動混勻后放入37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

注:復蘇第二天若細胞狀態(tài)較好,但漂浮碎片較多可做換液處理;

復蘇的細胞需要時間恢復狀態(tài),當復蘇好后密度低于80%時,2天內(nèi)暫時不要換液,細胞生長狀態(tài)恢復后再進行后續(xù)傳代等操作;

【細胞傳代】

當細胞匯合度達到80%-90%,即可傳代培養(yǎng)。

收集細胞:貼壁細胞可以參考以下方法1、吸去培養(yǎng)液,加入不含鈣鎂的PBS,輕輕潤洗瓶底1-2次,吸棄PBS;2、加入0.25%胰酶-EDTA消化液(T25瓶1-2mL,T75瓶2-3mL),鋪勻瓶底放入培養(yǎng)箱中消化1-2min;(部分細胞貼壁較牢,可采用分步消化:將消化下來的細胞轉(zhuǎn)移至離心管終止,在培養(yǎng)瓶中加入胰酶繼續(xù)消化,直至大部分細胞脫落)3、倒置顯微鏡下觀察大部分細胞變圓脫落,迅速加入完全培養(yǎng)基終止消化,完培與胰酶比例為2:1;4、輕輕吹打細胞后吸出轉(zhuǎn)移至離心管中。半貼壁半懸浮細胞需先收集懸液至離心管再參考貼壁細胞操作。

離心:收集好的細胞在1000rpm條件下離心3~5min,離心好后棄除上清液。

接種:準備好新的培養(yǎng)瓶并添加適量完全培養(yǎng)基,在離心管加入1-2mL完全培養(yǎng)基重懸吹打均勻,初次傳代將細胞懸液按1:2比例接種到新的培養(yǎng)瓶中,后續(xù)可根據(jù)細胞實際情況按1:2-1:4的比例傳代;接種完成后放入37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

懸浮細胞建議采用半換液傳代:將培養(yǎng)瓶站立靜置5-10min,肉眼可見細胞沉底,吸取1/2~2/3上清至離心管離心,將瓶內(nèi)剩余懸液按1:2或1:3的比例轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)瓶,將離心管中的細胞重懸后放入培養(yǎng)瓶添加新鮮完全培養(yǎng)基即可。

【細胞凍存】

收集細胞參考細胞傳代步驟。

凍存液重懸:細胞按照傳代步驟收集細胞至離心管并計數(shù),根據(jù)計數(shù)的密度決定細胞凍存數(shù)量,一般推薦細胞凍存密度為1×106-1×107個活細胞/管。離心后棄上清,加入配制好的凍存液重懸,分配到凍存管中,每管1mL。

凍存:將凍存管放入程序降溫盒中進行梯度降溫,然后放入-80℃冰箱降溫,24h后將凍存管轉(zhuǎn)入液氮罐中。若沒有凍存盒,可于冰箱4℃放置30min,隨后轉(zhuǎn)移至-20℃冷凍2h,接下來將其放于-80℃超低溫冰箱中過夜,最終放置于液氮中以長期保存。

 

參考文獻:[1]林武,黃昭帥,鮑苗,等.胚胎干細胞分泌因子增強AML-12細胞抗凋亡能力[J].溫州醫(yī)科大學學報,2018,48(06):408-412.

 

 

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